Gibson Assembly
Gibson Assemblyは、制限酵素サイトの有無に依存せず、複数のDNA断片を一度の反応でシームレス（塩基配列の継ぎ目なし）に連結できる強力なクローニング手法です。2009年に開発されて以来、その簡便さと設計の自由度の高さから、合成生物学や遺伝子工学の標準的な技術となっています。
原理
[Image of Gibson Assembly Mechanism] この反応は、同一チューブ内で行われる「等温ワンポット反応」であり、以下の3つの酵素活性が協調して働きます。
- 5'エキソヌクレアーゼ (5' Exonuclease): 二本鎖DNAの5'末端を削り込み、3'一本鎖のオーバーハング（のりしろ）を作り出します。
- DNAポリメラーゼ (DNA Polymerase): 隣り合う断片同士がオーバーラップ部分でアニーリングした後、生じたギャップを埋めます。
- DNAリガーゼ (DNA Ligase): 最後に残ったニック（切れ目）を共有結合で連結し、完全な二本鎖DNAを形成します（ぶっちゃけなくても大丈夫だそうです）。
ポイント：これらの反応が50℃という単一の温度で自律的に進行します。PCR断片や制限酵素処理産物では、のりしろ部分になる共通配列を設計しておけば大丈夫です。
実験プロトコル (Method)
1. プライマー設計とPCR
各DNA断片の末端に、隣接する断片と共通する配列（オーバーラップ配列）を付加するようにプライマーを設計します。
- オーバーラップ長: 20〜40 bp程度が推奨されます。断片数が多い場合や二次構造を取りやすい配列の場合は長めに設計します。
- Tm値: オーバーラップ部分のTm値が50℃以上になるように設計すると効率が良いです。
2. 反応溶液の調製
市販のGibson Assembly Master Mixを使用する場合の例です。氷上で操作を行います。
| 試薬 | 推奨量 (20µL反応系) |
|---|---|
| 2x Gibson Assembly Master Mix | 10 µL |
| DNA断片 (インサート + ベクター) | 合計 0.02 - 0.5 pmol |
| 滅菌水 | Up to 20 µL |
DNA量の目安：
ベクターとインサートのモル比は 1:2 〜 1:3 が理想的です。
例：ベクター(3kb) 50ng に対し、インサート(1kb) は約30〜50ng。
3. インキュベーション
反応液をサーマルサイクラーまたはヒートブロックで、50℃にてインキュベートします。
- 2〜3断片の場合: 15分〜30分
- 4断片以上の場合: 60分
4. 形質転換
反応終了後の溶液 2 µL を用いて、コンピテントセルを形質転換します。
成功のためのポイント
- DNAの純度：PCR後のテンプレートプラスミドの持ち込みを防ぐため、DpnI処理を行うか、ゲル切り出し精製を行ったDNA断片を使用することを強く推奨します（抗生物質が異なるベクターに節度くする場合はこの操作は不要です）。
- モル比の計算：断片の長さが大きく異なる場合、重量比(ng)ではなくモル比(pmol)で計算して混合すといいです。
- オーバーラップ配列の確認：オーバーラップ部分に繰り返し配列やヘアピン構造が含まれると、誤ったアセンブリの原因となります。設計ツール等で配列を確認しましょう。
トラブルシューティング
- コロニーが生えない、または極端に少ない
- DNA断片の濃度が低すぎるか、断片連結できていないことが多いですす。DNAを再精製し、濃度を確認してください。また、コンピテントセルの形質転換効率も確認しましょう（10^8 cfu/µg以上が望ましい）。
- コロニーは生えるが、目的のプラスミドではない
- ベクターのセルフライゲーション（未切断ベクターの混入）や、PCR産物の非特異的な増幅産物が組み込まれている可能性があります。PCR産物のゲル精製を徹底し、ベクターの制限酵素処理が完全であることを確認してください。