PCR (ポリメラーゼ連鎖反応)

PCR (Polymerase Chain Reaction) は、DNAサンプルのごく一部である特定の領域だけを、試験管内で数時間のうちに数百万～数十億倍に増幅する技術です。遺伝子クローニング、シーケンシング、遺伝子診断など、現代の生命科学研究において最も基本的かつ強力なツールの一つと言えます。

PCRの原理

PCRは、温度を変化させる3つのステップを繰り返すことで、DNAを指数関数的に増幅させます。

  1. 熱変性 (Denaturation) [約95℃]: 二本鎖の鋳型DNAを加熱することで、水素結合を切り離し、一本鎖のDNAに解離させます。
  2. アニーリング (Annealing) [約55-65℃]: 温度を下げ、プライマーと呼ばれる短い一本鎖DNAが、増幅したい領域の相補的な配列に結合（アニール）します。
  3. 伸長 (Extension) [約72℃]: DNAポリメラーゼ（耐熱性酵素）が、プライマーを起点として、鋳型DNAに相補的な新しいDNA鎖を合成していきます。

この3ステップを1サイクルとして25～35回繰り返すことで、目的のDNA断片が爆発的に増えていきます。

💡 ポイント：PCRは「DNAの特定ページ専門の超高速コピー機」のようなものです。プライマーが「このページから」「このページまで」と指定する付箋の役割を、DNAポリメラーゼがコピー機の役割を果たします。

準備するもの (Materials)

  • 鋳型DNA (プラスミドDNA, ゲノムDNAなど)
  • プライマーのペア (Forward Primer, Reverse Primer)
  • dNTPs (DNAの材料となる4種類の塩基)
  • 耐熱性DNAポリメラーゼ (Taq, Pfu, KODなど) と専用バッファー
  • 滅菌水 (Nuclease-Free Water)
  • サーマルサイクラー（PCR装置）、PCRチューブ

実験プロトコル (Method)

1. 反応溶液の調製

氷上で、各試薬をPCRチューブに加えていきます。複数サンプルある場合は、水、バッファー、dNTPs、プライマー、酵素を先に混ぜた「マスターミックス」を作ると、分注操作の誤差が減り、効率的です。

試薬推奨量 (50µL反応系)最終濃度
滅菌水Up to 50 µL-
10x PCR Buffer5 µL1x
dNTP Mixture (2 mM each)5 µL200 µM each
Forward Primer (10 µM)2.5 µL0.5 µM
Reverse Primer (10 µM)2.5 µL0.5 µM
鋳型DNA1-100 ng-
DNA Polymerase0.5 µL-

※上記は一例です。必ずお使いの酵素の推奨プロトコルに従ってください。

2. PCR装置での反応

調製したPCRチューブをサーマルサイクラーにセットし、適切なプログラムで反応を開始します。

ステップ温度時間備考
初期変性95℃2分最初のDNAを完全に一本鎖にする
サイクル (30回)95℃30秒熱変性
58℃30秒アニーリング (※プライマーによる)
72℃1分/kb伸長 (※増幅産物の長さによる)
最終伸長72℃5分不完全な伸長産物を完成させる
保持4℃∞反応後のサンプルを低温で保持

3. 結果の確認

反応後、PCR産物の一部（5µL程度）をアガロースゲル電気泳動に供し、目的のサイズの場所にバンドが見えるかを確認します。

💡 成功のためのポイント

  • プライマー設計が最重要：PCRの成否はプライマー設計で8割決まります。特異性が高く、適切なTm値を持ち、プライマーダイマーを形成しにくい設計を心がけましょう。
  • アニーリング温度の最適化：非特異的なバンドが出たり、バンドが全く出ない場合、まずはアニーリング温度を上下に2-3℃調整するのが定石です。
  • コンタミネーション対策は徹底的に：PCRは極微量のDNAを増幅するため、意図しないDNAの混入に非常に敏感です。フィルター付きチップの使用や、試薬・器具の丁寧な取り扱いを徹底しましょう。ネガティブコントロール（鋳型DNAなし）を必ず置き、コンタミがないことを確認する癖をつけましょう。

🤔 よくある失敗と対策 (Troubleshooting)

Q. バンドが全く増えない…
A. アニーリング温度が高すぎる、プライマー設計が不適切、鋳型DNAの品質が悪い（分解している、純度が低い）、酵素や試薬が劣化している、などの原因が考えられます。まずはアニーリング温度を下げて試すのが一般的です。

Q. 目的以外のバンドがたくさん出てしまう…
A. 非特異的バンドの主な原因は、アニーリング温度が低すぎることです。温度を2-3℃上げてみましょう。また、プライマー濃度やマグネシウムイオン濃度が高い場合も起こりえます。酵素の推奨プロトコルを確認しましょう。

Q. ネガティブコントロール（鋳型なし）からもバンドが見える…
A. これは試薬や器具、あるいは操作中のコンタミネーション（汚染）を意味します。試薬類を新しいものに交換したり、ピペットや実験台を清掃するなど、汚染源を特定して排除する必要があります。