T4 DNA Ligase

ここではDNA同士の連結をおこなうライゲーション反応について紹介します。道具でいう「のり」に当たるものです。

簡単な原理

T4 DNA Ligaseは、DNA分子のリン酸ジエステル結合を形成する酵素でDNAのライゲーション（結合）を行います。T4ファージから精製される酵素です。ATP存在条件下でDNAの5'末端のリン酸基と3'末端のヒドロキシル基を結合します。

Method

１．1.5mLチューブに反応溶液を調整する

Reagent 容量 最終濃度
Fragment 1（insert DNA） 比率5 -
Fragment 2（vector DNA） 比率1 -
T4 DNA Ligase 1µL -
10x Reaction Buffer 1 1x
DDW(H₂O) Up to 10 µL -

※insert DNAの量が多い方が形質転換したときの空ベクターの率が少なくなるのでおすすめです。

２．16℃で2hインキュベートする。

基本的なライゲーションはこれで終わりです。あとは形質転換なりPCRなり好きに利用しましょう。

末端とライゲーション時間

制限酵素などで切断したDNAの末端の形状によってライゲーション時間を変えるといいです。たとえはHindIIIで切断したDNA末端同士をライゲーションするとき、これは15分でも全然ライゲーションします。一方で平滑末端DNA同士のライゲーションは8時間以上ライゲーションさせた方がいいです。TAクローニングの際のライゲーションは4時間くらい、と使い分けるといいです。

自作のBufferで反応効率を上げる

市販の10x Bufferではなく、自作の10x BufferにPEG(ポリエチレングリコール)を加えることで、反応時間を短縮できます。

成分 濃度 備考
Tris-HCl 500 mM (pH 7.5) バッファー成分（pH調整済み）
MgCl₂ 100 mM T4 DNA Ligase活性に必要
ATP 10 mM 結合反応のエネルギー源
DTT 100 mM 酵素の安定化
PEG 4000 50% (w/v) クラウディング効果によりライゲーション効率向上

この濃度でBufferを作成すれば、それがそのまま10x Reaction Bufferになります。

作成日：2025/1/8