ゲノムPCR (Genomic PCR)
大腸菌や酵母などのゲノムDNAを鋳型として、目的の遺伝子を増幅する方法です。プラスミドPCRに比べて鋳型が巨大で複雑なため、少し工夫が必要です。
原理と注意点
ゲノムDNAは非常に長く絡まりやすいため、調製時に物理的な切断（シェアリング）を受けやすいです。また、GC含量の高い領域や繰り返し配列が含まれることが多く、通常のPCRよりも反応条件がシビアになります。
準備するもの
- 精製済みゲノムDNA (Genomic DNA)
- プライマー対
- 高効率DNA Polymerase (KOD FX Neo, Phusionなど推奨)
- GC Enhancer (DMSOなどで代用可、GCリッチな場合)
実験プロトコル
1. ゲノムDNAの調製
市販のゲノム抽出キットを使用するか、簡易抽出法（熱抽出など）を行います。大腸菌なら、コロニーPCRの要領で菌体を水に懸濁し、98℃ 5分加熱した上清をそのまま鋳型にすることも可能です。
2. 反応液の調製
ゲノムPCRでは、非特異的な増幅を防ぐため、酵素は「Hot Start対応」のものを使うのが強く推奨されます。
| 試薬 | 量 (50µL系) |
|---|---|
| 2x PCR Buffer (dNTPs, Mg含) | 25 µL |
| Forward Primer (10µM) | 1.5 µL |
| Reverse Primer (10µM) | 1.5 µL |
| Genomic DNA | 50 - 100 ng |
| DNA Polymerase | 1 U |
| 滅菌水 | up to 50 µL |
3. サイクル条件
初期変性の時間を長めにとるのがポイントです。
- 初期変性： 94-98℃, 2-5分（ゲノムを完全にほぐすため）
- サイクル（30-35回）： 通常のPCRと同様
- 伸長反応： 酵素の性能に合わせて設定（通常 30sec-1min/kb）
💡 成功のコツ
- 鋳型を入れすぎない：ゲノムDNAを多く入れすぎると、不純物の持ち込みや非特異吸着でPCR阻害が起きやすいです。薄い方がうまくいくことが多いです。
- プライマー設計：ゲノム上には類似配列が多数存在します。BLAST検索などで、プライマーが目的以外の場所に結合しないか確認しましょう。
- 2ステップPCR：Tm値が高い（>68℃）プライマーを設計し、アニーリングと伸長を同じ温度（68℃など）で行う「2ステップPCR」にすると、特異性が上がります。