PCR (Polymerase Chain Reaction)
DNAの特定領域を数百万倍に増幅する、分子生物学の基本中の基本技術です。
原理
熱変性（Denaturation）、アニーリング（Annealing）、伸長（Extension）の3ステップを繰り返すことで、DNAを指数関数的に増幅させます。Tmが高いプライマーを使用する場合には、伸長過程でアニーリングするため、2ステップのPCRでも大丈夫です。
準備するもの
- 鋳型DNA (Template DNA)
- Forward Primer / Reverse Primer (10 µM)
- DNA Polymerase (Taq, KOD, Pfuなど) & バッファー
- dNTP Mixture
- 滅菌水 (Nuclease-Free Water)
実験プロトコル
1. 反応液の調製 (50 µL系)
氷上で以下の試薬を混合します。
| 試薬 | 量 | 最終濃度 |
|---|---|---|
| 滅菌水 | up to 50 µL | - |
| 10x Buffer | 5 µL | 1x |
| dNTPs (2mM) | 5 µL | 0.2 mM |
| MgSO4 (25mM) ※必要な場合 | 2-3 µL | 1-1.5 mM |
| Forward Primer (10µM) | 1.5 µL | 0.3 µM |
| Reverse Primer (10µM) | 1.5 µL | 0.3 µM |
| Template DNA | < 200 ng | - |
| DNA Polymerase | 0.5 - 1 µL | 1 U |
2. サーマルサイクラーの設定
| ステップ | 温度 | 時間 | サイクル数 |
|---|---|---|---|
| 初期変性 | 94-98℃ | 2 min | 1 |
| 変性 | 94-98℃ | 10-30 sec | 25-35 |
| アニーリング | Tm - 5℃ | 30 sec | |
| 伸長 | 68-72℃ | 30-60 sec/kb | |
| 保存 | 4℃ | ∞ | 1 |
💡 成功のコツ
- 酵素選び：クローニング用には変異の入りにくい「高正確性酵素（KOD, Pfuなど）」を、確認用には安価で増えやすい「Taq」を使い分けましょう。Taqポリメラーゼは熱に弱いので、94℃で変性させることをお勧めします。
- アニーリング温度：プライマーのTm値より3〜5℃低く設定するのが基本です。バンドが出ない場合は温度を下げ、非特異バンドが出る場合は温度を上げます。
- PCRがかからないとき：Tmを5-10℃下げてみてください。それでもダメそうなら酵素を変えてみるか、終濃度5%のDMSOを加えることで解決する場合がありますので是非お試しあれ。